Aislamiento enzimático de protoplastos a partir de mesófilo de dioscorea alata cultivar �pico de botella"

A plant protoplast cell lacking a cell wall is surrounded by its plasma membrane and is potentially able to regenerate the cell wall, grow and divide. The aim of this study was to evaluate different commercial enzyme concentrations and times of action in the isolation of protoplasts of D. alata cultivar �Bottle Peak�. The protoplasts were isolated from mesophyll of vitroplants combining concentrations of the enzymes Cellulase Onozuka R10® (0,0 to 1,5% w/v) and Macerozyme R10® (0,0 to 0,5% w/v), to action times of 6 to 18h and pH of 5,6, giving approximately 0,015g of leaf protoplast isolation medium yam at 27 ± 2 °C, 40 rpm, followed by washing in isolation medium without enzymes, purification in 24% sucrose, resuspension in protoplast culture medium yam and counting in Neubauer camera. Most protoplasts were obtained with 1% Cellulase and 0,5% macerozyme in 18h of action, with an average of 18,6 x106 protoplasts g-1 fresh tissue. Regression analysis (R2 = 0,84) yielded the data obtained, optimum conditions for the most isolated protoplasts correspond to a combination of 0,96% Cellulase and 0,36% macerozyme to 13,99 h action, with an value estimated of 15,3 x106 protoplasts g-1 tissue. The enzymatic method to isolate protoplasts yam, recommended assessing their feasibility for cell wall regeneration, growing, dividing and forming microcolonies and microcallos.Un protoplasto vegetal es una célula que carece de pared celular, se encuentra rodeada por su membrana plasmática y es potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. El objetivo del trabajo fue evaluar diferentes concentraciones de enzimas comerciales y tiempos de acción en el aislamiento de protoplastos de Dioscorea alata cultivar �Pico de Botella�. Los protoplastos fueron aislados del mesófilo de vitroplantas combinando concentraciones de las enzimas Celulasa Onozuka R10® (0,0 a 1,5% p/v) y Macerozima R10® (0,0 a 0,5% p/v), a tiempos de acción de 6 a 18h y pH de 5,6; exponiendo aproximadamente 0,015g de hoja en medio de aislamiento de protoplastos de ñame a 27±2 °C, 40 rpm, seguido de lavado en medio de aislamiento sin enzimas, purificación en sacarosa al 24%, resuspensión en medio de cultivo de protoplastos de ñame y conteo en cámara de Neubauer. La mayor cantidad de protoplastos se obtuvo con Celulasa al 1% y Macerozima al 0,5% en 18h de acción, con un promedio de 18,6 x106 protoplastos g-1 de tejido fresco. Los análisis de regresión (R2 = 0,84) de los datos obtenidos arrojaron, que las condiciones óptimas para obtener la mayor cantidad de protoplastos aislados corresponden a una combinación de 0,96% de Celulasa y 0,36% de Macerozima, a 13,99 h de acción, estimando un valor de 15,3x106 protoplastos g-1 de tejido. El método enzimático permite aislar protoplastos de ñame, recomendándose evaluar su viabilidad para regeneración su pared celular, crecer, dividirse y formar microcolonias y microcallos